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RT-qPCR是分子生物研究中缺乏重復性的典范

2021/12/24 13:35:28??????點擊:

Real-Time qPCR(RT-qPCR)優(yōu)點眾多,目前已成為生命科學領域的一項常規(guī)技術,越來越多的研究文章中涉及到RT-PCR實驗,也基本上被Real-Time qPCR所替代。近十幾年來,RT-qPCR的論文大量發(fā)表,仍面臨著專業(yè)規(guī)范的問題。

主要表現(xiàn)在以下兩個方面>>

0 70%-80%提供數(shù)據(jù)仍不采用PCR實驗指南(MIQE)數(shù)據(jù)規(guī)范及實時定量PCR數(shù)據(jù)的結構化語言和報告指南(RDML)語言規(guī)范,表達不規(guī)范、說服力不足、結果表述不清、數(shù)據(jù)無法重復等問題導致被撤稿。

0 追求試劑“低價”或“品牌崇拜”,缺乏科學的試劑質(zhì)量評價 方法,方法體系的不嚴謹將造成錯誤的結論。


圖片

2017年Stephen Bustin等調(diào)查顯示——說一套,做一套,RT-qPCR是分子生物研究中缺乏重復性的典范。(Talking the talk, but not walking the walk:RT-qPCR as a paradigm for the lack of reproducibility in molecularresearch)作者指出許多分子生物學研究缺乏重現(xiàn)性的根本原因是分子測量方法報告不充分。RT-qPCR是RNA定量最直接的測量技術之一,廣泛應用于研究、診斷、法醫(yī)和生物技術應用,盡管定量PCR實驗指南(MIQE)旨在提高RT-qPCR數(shù)據(jù)報告的規(guī)范性和透明度,但調(diào)查顯示錯誤的試驗方法、不適當?shù)臄?shù)據(jù)分析和不充分的報告仍然普遍存在,大多數(shù)已發(fā)表的RT-qPCR數(shù)據(jù)可能造成實驗結論誤導。



01

結果再現(xiàn)性問題

2013年,《自然》(Nature)雜志發(fā)表的一篇論文綜述得出結論,自MIQE指南發(fā)布以來,有關RT-qPCR方案的必要信息的報告實際上有所惡化。雖然指南強烈建議納入必要的技術信息,但分析的10篇論文中沒有一篇報道了這一信息。這意味著沒有向讀者提供任何有關RNA完整性、RNA純度、RT條件或PCR效率的信息,而且所有的出版物都使用了一種不恰當?shù)臄?shù)據(jù)分析方法,這種方法在15年前已經(jīng)被質(zhì)疑。作者對《自然》雜志的20篇近期論文進行了重復分析,得出了基本相同的結論。更諷刺的是,報道透明度與期刊的影響因子呈負相關。


02

研究RNA表達的方法

RNA圖譜分析依賴于多種方法,有些方法相對簡單,有些方法則復雜得多,有些方法限制于低通量,還有一些方法允許并行處理大量樣本。作者對目前使用的主要RNA分析方法進行了簡要概述,闡述了許多使用基于RNA的方法發(fā)布的數(shù)據(jù)的可靠性和生物/臨床相關性引發(fā)激烈辯論的問題,并闡明了導致這些結果不可靠且需要修正的各種原因


01PCR是目前大多數(shù)使用的方法,而使用凝膠電泳進行PCR分析仍在繼續(xù)使用。對PCR相關衍生的問題的認識由來已久,早在1992年就有第一份報告描述了實驗室內(nèi)和實驗室之間對復制和連續(xù)標本進行評估的不一致性。缺乏一個涉及PCR的動態(tài)過程的理論理解,特別是關于不可復制或意想不到的擴增產(chǎn)物的擴增,在幾十年前也被強調(diào)。這些觀察結果和由此產(chǎn)生的影響在很大程度上被忽略了。
02

qPCR和RT-qPCR是快速、簡單定量核酸的方法,并繼續(xù)被廣泛使用,2016年PubMed搜索逆轉錄實時PCR或RT-qPCR或qRT-PCR,有近5400個引用。但是該方法的再現(xiàn)行。可靠性和一致性收到質(zhì)疑,


03

微陣列技術與RT-qPCR相比可以處理更多的樣本,比但由于執(zhí)行和分析數(shù)據(jù)所需的復雜性和時間的增加,這種方法的流行度正在下降,2016年PubMed搜索“微陣列”一詞大約有1600個引用。


04

RNA-seq是所有RNA profiling方法中技術最復雜、最昂貴、最耗時的一種,使得復制或重復實驗的可行性較低。


05

另外兩種中等通量的RNA分析方法是NanoString公司的nCounter分析系統(tǒng)和Thermo Fisher公司的OpenArray系統(tǒng)。前者的優(yōu)點是不需要RT步驟,后者減少了所需的樣品處理量。比較兩種技術和RT- qPCR的mRNA豐度分析發(fā)現(xiàn),三種方法的結果具有廣泛的可比性。然而,盡管NanoString和OpenArray的結果有很好的相關性,但RT- qPCR數(shù)據(jù)與兩者有顯著差異。作者將其歸因于常規(guī)RT-qPCR需要大量的移液操作,從而增加了樣品制備的可變性。這些結果也表明,即使以適當?shù)姆绞竭M行了技術和分析,結果也可能是不一致的。這也存在一種可能,即RT-qPCR結果是正確的,而其他兩種方法得到的結果是錯誤的。


03

RT-qPCR存在的問題

RT- qPCR工作流程表面上簡單的結果是,一方面,許多未經(jīng)培訓和不熟練的操作人員采用了這項技術。另一方面,不知道從哪里查找并識別問題所在,確定報告的結果是否可能是真實的。下面概述了妨礙對結果進行一致解釋的方法問題,并舉例說明了為什么報告的結果常常如此不可靠。


01RNA的質(zhì)量

相關的質(zhì)量控制措施是任何分子生物學實驗前的必要準備工作,包括確??煽康膓PCR檢測。RNA在提取和保存過程中有各種物理和化學因素的降解核酸,因此純度和完整性是非常重要的。RIN值大于5的總RNA可以劃分為優(yōu)質(zhì)RNA,大于8的RNA可以劃分為完美RNA。這并不是一個理想的分類,因為降解與抑制類似,它不是一個恒定或穩(wěn)定的過程,而是以不同的方式影響轉錄。這種不一致的一個嚴重后果是,對純度或降解程度不同的樣品進行比較,可能會顯示出差異,實際上并沒有差異,或者掩蓋了任何實際差異。這種不一致性直接影響基因表達結果,從而會影響實驗結論。



02逆轉錄步驟

在首次PCR實驗報道后不久,結合RT和PCR步驟檢測RNA靶點的潛力就被發(fā)現(xiàn)了,并在隨后不久被建議將其用作定量分析。隨后發(fā)現(xiàn),定量RNA并不像定量DNA那樣簡單,比如RNA逆轉錄后通過PCR進行擴增取決于RNA濃度和引物設計以及在引物結合位點避免大量的二級結構,不同的RT酶受到這些二級結構的不同影響。逆轉錄步驟實際上是可變的,因為它是由不同的實驗人員進行的,實驗人員使用了不同數(shù)量的RNA、各種cDNA反轉錄的方法和不同的逆轉錄酶。這導致了不同實驗室報告的RT-qPCR結果可能不一致,而且很難確定哪些結果是真實的,哪些結果是錯誤的,尤其是在沒有足夠的分析設計參數(shù)和實驗方案信息的情況下。



03PCR步驟

聚合酶鏈反應的穩(wěn)定性并不像看上去那么好,這有幾個原因:

a.許多已發(fā)表的PCR分析要么設計不充分,不可能只擴增預期的目標,要么發(fā)表的信息不正確,導致發(fā)表錯誤的引物或探針序列;

b.最佳的PCR性能在很大程度上取決于適當?shù)哪0逯苽浞椒ǎ?/span>

c.認為qPCR檢測分辨率足夠高的假設是錯誤的。

d.不同制造商的“定量PCR預混液”是不同的,不同預混液可能會影響最后的“差異倍數(shù)”值;

e.對于一些目的基因,選擇一步法RT-qPCR和兩步法RT-qPCR也會造成結果的不一致;

f.許多商業(yè)化熱啟動Taq在熱啟動前似乎沒有經(jīng)制造商的封閉性測試,容易產(chǎn)生非特異性擴增,形成引物二聚體;

g.目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率不在線性范圍內(nèi),而且二者的擴增效率也不一致,這極大影響了實驗結果的真實性。



04

規(guī)范操作建議

01引物和探針的驗證

由于任何PCR檢測的特異性和效率都嚴重依賴于引物和探針,如果使用,這些都需要仔細檢查。實際應用中有頻繁的錯誤,包括簡單的排版錯誤,對寡核苷酸序列取向混亂,缺乏特異性的引物,設計跨內(nèi)含子的PCR擴增子。

02測定核酸的質(zhì)量和完整性

核酸的質(zhì)量和完整性對于定量結果的影響是很大的,報告中為提供此項內(nèi)容,意味著永遠不清楚作者是否真的檢查了抑制劑的存在,并確定了RNA樣本的完整性,或者只是不報告他們的結果。

03RT步驟做3個重復

RT步驟應該以3個重復的方式進行,而對于每個RT反應只進行一個qPCR就足夠了。

04PCR的擴增效率應該一致

擴增效率的不一致,在使用2-△△cq進行基因表達分析時,得到的fold changes值是不準確的,不是真實變化值,這可能會極大地提高基因表達分析的準確性。

05選擇穩(wěn)定表達的內(nèi)參

使用多個、穩(wěn)定且經(jīng)過驗證的內(nèi)參基因?qū)T-qPCR數(shù)據(jù)歸一化至關重要,因為它消除了固有技術或?qū)嶒炚T導的差異。

06提供原始數(shù)據(jù)

Cq數(shù)據(jù)應該作為補充信息提交,可以以電子表格的形式提交,也可以直接以RDML格式導出。


為了幫助科研用戶更好地甄別定量試劑的特異性和穩(wěn)定性,提高實驗的重現(xiàn)性可嚴謹性,我們推出了NTC挑戰(zhàn)市場活動(僅擴增無模板陰性對照),得到了熱烈反響,在活動推出一個月以來,我們收到了來自不同單位的大量的對比數(shù)據(jù),充分證明了試劑間存在的差異會導致定量結果的巨大差異,下面附上三個案例



案例一

北大某課題組,所用試劑為QST-100和國內(nèi)B公司、Y公司,使用儀器為 ABI 7500.


由擴增曲線和CT值可知,QST-100的CT值最高,特異性和穩(wěn)定性最好。





案例二

農(nóng)科院某課題組,所用試劑為QST-100、國內(nèi)Y公司、V公司和國內(nèi)T公司,所用儀器為伯樂C1000.


由擴增曲線和CT值可知,QST-100的CT值最高,特異性和穩(wěn)定性最好。


案例三

中山大學某課題組,所用試劑為QET-100和國外T公司,使用儀器為ABI QuantStudio DX

    


由擴增曲線和CT值可知,QET-100的CT值最高,特異性和穩(wěn)定性最好。


從客戶反饋的報告來看,市面上大多數(shù)試劑未能滿足MIQE無模板對照不出現(xiàn)擴增的條件,導致實驗數(shù)據(jù)的可信度降低,強烈建議科研用戶選擇符合MIQE的試劑。  QST-100在客戶端也受到了廣泛好評  

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產(chǎn)品介紹

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